Сергей Безруков родился 18 октября 1973 года в семье актера и режиссера Виталия Безрукова. Имя он получил в честь любимого поэта — Сергея Есенина.
Первую роль в театре сыграл еще школьником в спектакле «Мой бедный Марат» (Леонидик).
После школы Безруков поступил в Школу-студию МХАТ, на курс Олега Табакова. В 1994 году был принят в труппу его театра-студии, но кроме «Табакерки» он всегда активно работал и на других сценах.
С 1995 года Безруков участвовал в озвучании сатирической передачи «Куклы». Он имитировал голоса множества политиков, включая президента России Бориса Ельцина, лидера ЛДПР Владимира Жириновского и президента СССР Михаила Горбачева. В 1999 году актер решил, что вырос из этого формата, и покинул программу.
Самой известной ролью Безрукова стал Сергей Есенин. Впервые он сыграл поэта в 1995 году в постановке театра имени Ермоловой «Жизнь моя, иль ты приснилась мне?». За эту роль актеру вручили Государственную премию. В 2005 году Сергей Безруков сыграл главную роль в сериале «Есенин», снятом по сценарию его отца.
В 2008 году в антрепризе вышел моноспектакль «Хулиган», срежиссированный самим актером. Позже новая версия этого спектакля шла в Московском губернском театре под названием «Хулиган. Исповедь». Также он записал альбом песен на стихи Есенина.
В кино Безруков снимался со студенчества, но всенародную известность получил после роли Саши Белого в сериале «Бригада» в 2002 году. После этого актер начал очень активно работать в кино. Он играл разные роли, но чаще всего — различных исторических персонажей.
В 2011 году вышел фильм «Высоцкий. Спасибо, что живой». Имя актера, сыгравшего Высоцкого, в титрах не указывалось, однако позже стало известно, что это был Безруков, исполнивший в картине еще одну небольшую роль.
В 2013 году Безруков стал художественным руководителем Московского губернского театра, образованного в результате слияния двух областных театров. Одной из особенностей заведения стала доступность для людей с ограниченными возможностями: там есть пандусы и лифты для маломобильных зрителей и тифлокомментирование для слабовидящих. За это театр получил премию «Инновационный прорыв».
Безруков регулярно фигурирует в списках самых дорогих актеров российского кино. По сведениям СМИ, за один съемочный день он получает 500 тыс. рублей. В 2023 году сообщалось, что он зарабатывает более 100 млн рублей ежегодно.
Жена Безрукова — режиссер Анна Матисон. У них трое детей, в интервью актер говорил о планах усыновить еще одного малыша. Также у актера есть двое детей от петербургской актрисы Кристины Смирновой.
